Саузерн блот гибридизация
10 мкг геномной ДНК, выделенной из печени стерляди, инкубировали в течение 2 часов с эндонуклеазами рестрикции Pst I и Pvu II (по 50 е.а.) при 37оС в буфере, содержащем 100 мМ NaCl, 10 мМ трис-HCl, рН 7,5, 10 мМ MgCl2, 100 мкг/мл бычий сывороточный альбумин, 6 мМ 2-меркаптоэтанол. Затем экстрагировали ДНК последовательно равными объемами фенол-хлороформа (1:1) и хлороформа, осаждали ДНК двумя объемами этанола, растворяли в воде и наносили на 1% агарозный гель. Электрофорез проводили при напряжении 1 В/см и температуре 12оС в течение 12 часов. Затем гель инкубировали при комнатной температуре 30 мин в 0,25 М HCl, 30 мин в денатурирующем растворе (0,5 М NaOH, 1,5 M NaCl) и 10-15 мин в растворе 1 (0,25 М NaOH, 1,5 M NaCl). После этого ДНК переносили на нейлоновую мембрану методом вакуумного переноса в растворе 1. Мембрану споласкивали в 2-кратном SSC, высушивали и фиксировали ДНК в течение 10 мин ультрафиолетовым излучением с длиной волны 310 нм.
Предгибридизацию проводили при 55оС в течение 1 часа в растворе 1 (см. Скрининг библиотеки кДНК). Гибридизация длилась 12-16 часов при 55оС с концентрацией зонда не более 10 нг/мл.
Отмывку проводили два раза по 10 мин в 2-кратном SSC + 0,1% SDS при комнатной температуре и один раз 15 мин в 1-кратном SSC + 0,1% SDS при 55оС. Экспонирование длилось 12 часов при -70оС (Маниатис и др., 1984).
РЕЗУЛЬТАТЫ
КОНСТРУИРОВАНИЕ БИБЛИОТЕКИ кДНК И ЕЕ СКРИНИНГ
В качестве источника мРНК брали лейкоциты периферической крови стерляди. На основе этой мРНК синезировали кДНК. Полученные молекулы кДНК клонировали в плазмидном векторе pBluescript KS(+), после чего трансформировали этим вектором клетки E.coli штамма XL-1 Blue MRF’. В результате этого была получена библиотека кДНК представительностью 6 миллионов клонов. Библиотеку амплифицировали до объема 5 х 1011 клеток.
Cуммарную плазмидную ДНК библиотеки выделяли и использовали в ПЦР с парой праймеров, один из которых гомологичнен участку вектора вблизи сайта клонирования молекулы кДНК и располагается в кодирующей ориентации. Второй праймер вырожденный, соответствующий наиболее консервативному участку последовательности J-сегментов L-цепей ИГ позвоночных в некодирующей ориентации.
Один из фрагментов ДНК, полученных в результате ПЦР, соответствовал ожидаемому размеру (370 пн). Этот фрагмент выделяли и субклонировали в векторе pBluescript KS(+). Определение нуклеотидной последовательности этого фрагмента показало, что он гомологичен генам V области L-цепей ИГ.
Этот фрагмент был использован в качестве зонда для скрининга библиотеки кДНК лейкоцитов стерляди. Скрининг 4000 колоний библиотеки кДНК в мягких условиях гибридизации позволил выявить пять клонов с размером вставки кДНК от 800 до 1050 пн. Для четкого разделения клонов проводили вторичный скрининг библиотеки кДНК, после чего выделенные клоны амплифицировали.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПЕРВИЧНОЙ СТРУКТУРЫ
Определена нуклеотидная последовательность вставки кДНК клона В1. кДНК клона В1 размером 1050 пн представляла собой полноразмерную копию зрелого гена L-цепи ИГ и содержала 5’-нетранслируемую область, последовательность кодирующую лидерный пептид, V область, С область, а также 3’-нетранслируемую область. На основе первичной структуры клона В1 сконструировали и синтезировали три праймера, соответствующих консервативным районам V и C области и использовали их для определения нуклеотидной последовательности клонов Е4 и С2. Последовательность клона Е4 была определена только в области, примыкающей к Т3 промотору вектора. За исключением 2 нуклеотидов она полностью идентична последовательности В1. Последовательность клона С2 имела химерный характер. В области Т3 промотора она содержала фрагмент соответствующий 3’ части С сегмента клона B1 с заменами нескольких нуклеотидов.
то же время использование для определения последовательности праймеров V и C области показало, что эта вставка содержит дополнительно перестроенный ген легкой цепи, содержащий большую часть V сегмента и второй С сегмент, отличающийся от первого в одной позиции. Поскольку пока не удалось определить последовательность в области стыка этих двух фрагментов вставки, нельзя сказать, находятся ли они в одной или разных ориентациях. По-видимому, сходный химерный характер имеет последовательность клона D2 (данные не показаны).
Источник: www.medintime.ru
Саузерн-блот гибридизация (Southern blot hybridization)
Блоттингом (буквально — промакивание) называют перенос фрагментов макромолекул (ДНК, РНК или белка), разделенных с помощью электрофореза в геле, на твердую подложку — мембрану. В исследованиях генома человека часто используют метод блоттинга, разработанный Саузерном, при котором олигонуклеотидный зонд, находящийся в растворе, гибридизуется с ДНК, адсорбированной на мембране (Саузерн-блот гибридизация, Southern blot hybridization). Геномную ДНК (обычно выделенную из лейкоцитов или клеток плода) расщепляют на короткие фрагменты, разделяют их в агарозном геле, переносят на мембрану, после чего идентифицируют специфические участки с помощью гибридизации с олигонуклеотидными зондами ( рис. 65.6 ). Этим методом выявляют уникальные фрагменты ДНК, размер которых составляет приблизительно одну миллионную часть генома.
Значимость метода для медицины обусловлена возможностью исследовать определенный фрагмент геномной ДНК у любого человека.
Метод используют для выявления крупных перестроек в ДНК и некоторых точечных мутаций (большинство точечных мутаций этим методом выявить нельзя).
Денатурация ДНК осуществляется с щелочью. После окончания электрофореза гель помещают в раствор основания (щелочи), в котором двухчепочечные фрагменты ДНК теряют связи и становятся одноцепочечными.
Перенос ДНК с геля на нитроцеллюлозный или нейлоновый фильтр производится в буферном растворе. Непосредственно на поверхность геля кладут фильтр и стопку фильтровальной бумаги. За счет капиллярного эффекта создается ток буфера, перпендикулярный плоскости геля. Вымываемая из геля ДНК задерживается фильтром и практически полностью оказывается на его поверхности. После переноса одночепочечные нити фиксируют на фильтре. Расположение фрагментов на фильтре точно соответствует их расположению в геле. 3. Для того чтобы визуально выявить нужные фрагменты (фиксированная на фильтре ДНК не видна), проводят гибридизацию со специфическим по нуклеотидной последовательности меченным радионуклидам или флюоресцентной меткой олигонуклеотидным синтетическим зондом (такой зонд состоит из 16-30 пар осваний), или клонированным фрагментом ДНК. Нуклеотидная последовательность зонда должна быть полностью или частично комплементарна изучаемому участку геномной ДНК.
При инкубации фильтра с раствором, содержащим меченый зонд, происходит гибридизация комплементарных цепей ДНК зонда и фрагмента на фильтре. Неспецифические связанные молекулы зонда отмываются с помощью специальной процедуры.
Радиоактивно меченные участки выявляют путем экспонирования фильтра с рентгеновской пленкой (ауторадиография). После проявления на пленке видны полосы меченной зондом ДНК.
Нерадиоактивные метки визуализируют с помощью флюоресценции или опосредованно с помощью антител.
Итак: Саузерн-блот гибридизация — метод анализа структуры заданной области генома, основанный на:
— 1) расщеплении геномной ДНК с помощью эндонуклеаз рестрикции ;
— 2) разделении множества полученных фрагментов с помощью электрофореза в плоской пластине агарозного или другого геля;
— 3) перенесении продуктов разделения на лист пористого материала, например, на нитроцеллюлозный фильтр таким образом, что все фрагменты ДНК переносятся на фильтр и закрепляются на нем, создавая отпечаток, идентичный распределению фрагментов в геле после разделения;
— 4) гибридизации фильтра с меченым радиоактивно или с помощью красителя фрагментом ДНК или РНК (пробой), который по последовательности соответствует анализируемому участку генома. В результате, проба за счет комплементарных взаимодействий связывается с теми участками фильтра, где находятся исследуемые фрагменты генома, и положение этих фрагментов идентифицируется по положению метки из пробы на фильтре.
И как было сказано выше, с помощью Саузерн-блот гибридизации удается определять идентичность или различие длин фрагментов ( полиморфизм длин рестриктных фрагментов, ПДРФ ), получаемых при рестриктном расщеплении одного и того же локуса в разных сравниваемых геномах.
.
Источник: medbiol.ru
33
3. Разрезание (расщепление) молекул ДНК на фрагменты выполняют с помощью специальных ферментов — рестриктаз. Рестриктазы (эндодезоксирибонуклеазы рестрикции) относятся к ферментам класса гидролаз, катализирующих гидролиз фософодиэфирных связей. Первые ферменты EcoB и EcoK были выделены из штамма К12 кишечной палочки Е.соli. Ферменты имеют высокую специфичность к определённой последовательности ДНК, но расщепляют её неспецифично. Позднее были выделены ферменты, обладающие не только высокой специфичностью узнавания, но также специфично расцепляющие молекулу ДНК, например, BclI, источником которой является Bacillus caldolyticus. BclI расщепляет ДНК в участках :
5’-…Т|ГАТЦА…-3’ 3’-…AЦТАГ|T…-5’
4.Разделение фрагментов ДНК в зависимости от их размера (длины) и формы выполняют методом электрофореза в 1% агарозном геле. Процесс разделения основан на способности молекул ДНК мигрировать в толще агарозного геля под действием приложенного электрического поля. Вследствие того, что сахарофосфатный остов ДНК несёт отрицательный заряд, то все фрагменты ДНК движутся от катода — по направлению к положительно заряженному аноду.
5.Перенос фрагментов ДНК на мембранный фильтр (блоттинг).
Нитроцеллюлозную (или нейлоновую) мембрану помещают сверху агарозного геля. Для успешного переноса необходим плотный контакт геля и мембраны. Капиллярными силами ДНК из участка с высоким содержанием воды (гель) переносится в зону с низким содержанием воды (мембрана). При этом полианионная ДНК связывается с положительно заряженной мембраной силами ионообменных взаимодействий.
6.Выбор ДНК-зонда. Для детекции целевого фрагмента ДНК используют короткие фрагменты ДНК (20-30 п.н.), строго комплементарные последовательности ДНК-мишени и содержащие специфическую метку (радиоактивные изотопы, флуоресцеины, биотин и др.). Выбор метки зависит от нескольких факторов, таких как: природа зонда, необходимой чувствительности, легкости в использовании, и времени на проведения исследования.
7.Денатурация проводится с целью получения одноцепочечных молекул ДНК, способных комплементарно взаимодействовать между собой. Денатурацию фрагментов геномной ДНК в мембране выполняют с помощью щёлочи, а ДНК-зодна — путем нагревания до 95-98 оС.
Источник: StudFiles.net
Метод
- Рестрикция эндонуклеазами рестрикции для разрезания высокомолекулярной ДНК на более мелкие фрагменты.
- Фрагменты ДНК подвергаются электрофорезу в агарозном геле для разделения по длине.
- В случае, если некоторые фрагменты ДНК длиннее 15 тыс.
1087;. н., перед переносом гель обрабатывают, например, соляной кислотой, которая вызывает депуринизацию ДНК и облегчает перенос на мембрану. - В случае, когда используют щелочной метод переноса, агарозный гель помещают в щелочной раствор, .
088;яженной ДНК с положительно заряженной мембраной для дальнейшей гибридизации. При этом разрушаются и остатки РНК. - Листок нитроцеллюлозной (или нейлоновой) мембраны помещают сверху или снизу от агарозного геля. Давление осуществляют непосредственно на гель или через несколько слоев бумаги. Для успешного переноса необходим плотный контакт геля и мембраны. Буфер переносится капиллярными силами из участка с высоким содержанием воды в зону с низким содержанием воды (мембрана). При этом осуществляется перенос ДНК из геля на мембрану. Полианионная ДНК связывается с положительно заряженной мембраной силами ионообменных взаимодействий.
- Для окончательного закрепления ДНК на мембране, последняя нагревается в вакууме до температуры 80 °C в течение двух часов или освещается ультрафиолетовым излучением (в случае нейлоновых мембран).
- Осуществляют гибридизацию радиоактивно (флюоресцентно) меченной пробы с известной последовательностью ДНК с мембраной.
- После гибридизации избыток пробы отмывают с мембраны и визуализируют продукты гибридизации путём авторадиографии (в случае радиоактивной пробы) или оценивают окраску мембраны (в случае использования хромогенного окрашивания).
Результаты
Гибридизация пробы со специфическим участком ДНК, закрепленным на мембране, указывает на наличие анализируемой последовательности нуклеотидов в пробе.
Применение
Саузерн-блоттинг, который проводят с геномной ДНК, обработанной эндонуклеазами рестрикции, может быть использован для определения числа копий генов в геноме. Проба, которая гибридизуется только с единственным фрагментом ДНК, который не был разрезан рестриктазами, дает одну полосу на Саузерн-блоте, в то время как множественные полосы на блоте указывают на то, что проба гибридизовалась с несколькими идентичными последовательностями. Изменения условий гибридизации (повышение температуры, при которой проводят гибридизацию, изменение концентрации соли) приводят к повышению специфичности и снижению гибридизации с близкими, но не идентичными последовательностями.
Источник: www.gpedia.com
Метод
- Рестрикция эндонуклеазами рестрикции для разрезания высокомолекулярной ДНК на более мелкие фрагменты.
- Фрагменты ДНК подвергаются электрофорезу в агарозном геле для разделения по длине.
- В случае, если некоторые фрагменты ДНК длиннее 15 кб, перед переносом гель обрабатывают, например, соляной кислотой, которая вызывает депуринизацию ДНК и облегчает перенос на мембрану.
- В случае, когда используют щелочной метод переноса, агарозный гель помещают в щелочной раствор, при этом двойная спираль ДНК денатурирует и облегчает связывание отрицательно заряженной ДНК с положительно заряженной мембраной для дальнейшей гибридизации. При этом разрушаются и остатки РНК.
- Листок нитроцеллюлозной (или нейлоновой) мембраны помещают сверху или снизу от агарозного геля. Давление осуществляют непосредственно на гель или через несколько слоев бумаги. Для успешного переноса необходим плотный контакт геля и мембраны. Буфер переносится капиллярными силами из участка с высоким содержанием воды в зону с низким содержанием воды (мембрана). При этом осуществляется перенос ДНК из геля на мембрану. Полианионная ДНК связывается с положительно заряженной мембраной силами ионообменных взаимодействий.
- Для окончательного закрепления ДНК на мембране, последняя нагревается в вакууме до температуры 80 °C в течение двух часов или освещается ультрафиолетовым излучением (в случае нейлоновых мембран).
- Осуществляют гибридизацию радиоактивно (флюоресцентно) меченной пробы с известной последовательностью ДНК с мембраной.
- После гибридизации избыток пробы отмывают с мембраны и визуализируют продукты гибридизации путем авторадиографии (в случае радиоактивной пробы) или оценивают окраску мембраны (в случае использования хромогенного окрашивания).
Результаты
Гибридизация пробы со специфическим участком ДНК, закрепленным на мембране, указывает на наличие анализируемой последовательности нуклеотидов в пробе.
Применение
Саузерн блоттинг, который проводят с геномной ДНК, обработанной эндонуклеазами рестрикции, может быть использован для определения числа копий генов в геноме. Проба, которая гибридизуется только с единственным фрагментом ДНК, который не был разрезан рестриктазами, дает одну полосу на Саузерн-блоте, в то время как множественные полосы на блоте указывают на то, что проба гибридизовалась с несколькими идентичными последовательностями. Изменения условий гибридизации (повышение температуры, при которой проводят гибридизацию, изменение концентрации соли) приводят к повышению специфичности и снижению гибридизации с близкими, но не идентичными последовательностями.
Источник: dic.academic.ru
